在藥物分析過程中對活性物質的含量表征是非常重要的,很多小分子活性物質由于與大分子結合或共存而給其分離測定帶來困難,其往往是藥物分析工作的關鍵。 在藥物制劑的分析中,通常采用有機溶劑提取或是加入沉淀劑的方法把待分析物從藥物基質中分離出來,然而在這些分離富集過程中,一般比較繁瑣、費時,提取或沉淀不*的大分子會吸附在色譜柱的填料上,甚至堵塞填料小孔,縮短色譜柱的使用壽命。尤其當極性相近的活性小分子與大分子輔料分離時,采用傳統(tǒng)的相分離方法很難達到理想的效果。這些樣品前處理方法是影響分析結果準確性和重現(xiàn)性的主要因素,特別是大多數傳統(tǒng)的樣品前處理方法,首先都需要將大分子分離出來,其操作步驟繁瑣、費時。 在分離測定生物樣品中的小分子時,傳統(tǒng)的除蛋白過程中的pH變化、有機溶劑提取時環(huán)境中有機溶劑體積分數的增加,破壞了待分析物在生物基質中的存在環(huán)境,藥物與生物基質的結合狀態(tài)發(fā)生了改變。因而,在進行藥物濃度分析時,無法得到游離藥物的濃度信息,藥物在這些生物樣品中的濃度只能以藥物的總濃度進行表征。若需要單獨分析表征游離藥物時,不能破壞生物基質原來的生存狀態(tài)、保證藥物與生物基質的結合狀態(tài)不發(fā)生變化是分析工作的關鍵。 超濾方法是能將小分子從復雜基質中分離的方法之一。超濾技術已經廣泛應用于大規(guī)模的生物藥物制備純化過程中,用于分析樣品處理的小型超濾裝置也有報道,其裝置大多是在離心管中平行放置一超濾膜,在離心力條件下進行離心超濾。但是,由于平膜會產生很大的濃差極化,間接導致膜滲流量下降和分離效率降低,濾液難于收集,同時昂貴的分析成本,也使得其難于普及。為此,本課題設計了一種簡單廉價的微型離心超濾裝置,用于藥物分析中樣品的前處理。 課題采用的微型離心超濾裝置,是以中空纖維超濾膜為分離介質來解決在藥物分析中復雜基質樣品中的大、小分子分離問題。該裝置利用了樣品在離心超濾時,離心力與中空纖維膜平行,離心力消除了膜表面的濃差極化現(xiàn)象。與傳統(tǒng)的的方法相比,簡化了有機溶劑提取或是加入沉淀劑時的繁瑣、費時的步驟,減少了分析成本,同時分離過程無相變過程,減少了沉淀吸附。這樣該裝置不僅可用于藥物制劑分析中大分子干擾物質的分離,而且,還可用于生物體液中游離藥物的分析。在對游離藥物濃度進行分析時,避免了沉淀試劑在沉淀過程中對樣品的稀釋以及提取有機溶劑對藥物結合狀態(tài)的破壞。不經任何處理的血漿經過簡單的離心超濾后就能直接進行色譜分析,從而獲得準確的游離藥物濃度信息。該分析方法的建立為臨床游離藥物的監(jiān)測,提供了有效的分離方法,更能真實的反映藥物濃度與藥理強度的關系,為藥物的質量控制提供了更加有力的手段。 一、中空纖維離心超濾法用于表征藥物制劑中的小分子 （一）中空纖維離心超濾-液相色譜法測定靜脈注射用人免疫球蛋白中的麥芽糖 目的：利用中空纖維離心超濾技術快速分離人免疫球蛋白樣品中的麥芽糖,并用液相色譜法測定其含量。 方法：取樣品溶液約10 mL置于中空纖維離心超濾裝置中,在1.25×103g的離心力下,離心15 min,用注射器抽取濾液20μL,直接注入HPLC分析。分析方法采用Inertsil NH2色譜柱（250 mmx4.6 mm,5μm）及示差折光檢測器,流動相為乙腈-水（70：30）,柱溫40℃,流速1.0mL-min-1。 結果：樣品經離心超濾后,濾液無蛋白的干擾,能夠直接進行色譜分析。該方法可用于免疫球蛋白中麥芽糖分析的前處理,方法簡單、快速,回收率良好,平均加樣回收率為99.9%,RSD為1.4%。麥芽糖在1.00mg-mL-1～5.00 mg·mL-1濃度范圍內線性關系良好（r=0.9999）。 結論：采用中空纖維離心超濾法克服了濃差極化和吸附現(xiàn)象。與傳統(tǒng)的沉淀蛋白的方法相比,經過離心超濾后的濾液無大分子球蛋白的干擾,結果更加準確,并延長了色譜柱的使用壽命。該方法的建立為微量樣品的分析提供了簡單廉價的超濾手段,適合于蛋白類制品小分子測定的前處理。相色譜 （二）羥丙甲纖維素滴眼液中苯扎溴銨的中空纖維離心超濾-HPLC測定 目的：利用中空纖維離心超濾法對羥丙甲纖維素滴眼液進行樣品前處理,以除去大分子羥丙甲纖維素對色譜系統(tǒng)的損害,建立了簡單快速測定羥丙甲纖維素滴眼液中苯扎溴銨含量的方法。 方法：將樣品置于中空纖維超濾裝置中,在1.25×103g的離心力下,離心15 min,使羥丙甲纖維素滴眼液中的大分子羥丙甲纖維素與小分子苯扎溴銨得到良好的分離,抽取中空纖維內濾液20μL,直接進行HPLC分析。分析方法采用Hypersil C18（250 mm×4.6 mm,5μm）色譜柱；流動相為乙腈-70mmol·L-1乙酸銨溶液（含1%三乙胺,冰乙酸調節(jié)pH值為5.0）（70：30）,流速1.0 mL·min-1;檢測波長262 nm。 結果：采用的中空纖維離心超濾方法在15 min就能得到足夠分析測定使用的濾液,排除了羥丙甲纖維素對色譜系統(tǒng)的損害,延長了色譜柱壽命。平均回收率為99.6%,RSD為1.1%,苯扎溴銨在12.5μg·mL-1～200μg·mL-1濃度范圍內線性關系良好（r=0.9999）。 結論：該法經過15 min簡單的離心就分離出小分子苯扎溴銨,大分子羥丙甲纖維素對色譜系統(tǒng)無損害,且裝置中的中空纖維可以多次使用,降低了分析成本。該方法的建立為羥丙甲纖維素滴眼液中苯扎溴銨的分離分析提供了新的、方便實用的手段。 （三）一種簡單的中空纖維離心超濾-HPLC直接測定人血白蛋白中的乙酰色氨酸的含量 目的：建立利用中空纖維超濾技術進行人血白蛋白樣品簡便的前處理方法,結合HPLC法測定樣品中的乙酰色氨酸含量。 方法：將1 mL樣品溶液用重蒸水稀釋100倍,加入0.1%的磷酸100μL后,取10 mL置于用甘氨酸飽和后的中空纖維超濾裝置中離心15 min,從中空纖維中抽取濾液20μL,直接注入HPLC分析。分析方法采用HypersilC18（250 mm×4.6 mm,5μm）色譜柱,流動相為甲醇-水（45：55）（含0.1%磷酸）,流速1.0mL·min-1,檢測波長280 nm。 結果：人血白蛋白樣品溶液在經過甘氨酸處理的中空纖維離心超濾裝置中,能夠將乙酰色氨酸從人血白蛋白中分離出來,離心后中空纖維內的濾液易于收集,可直接進行色譜分析。經過甘氨酸處理后的中空纖維能夠克服乙酰色氨酸在中空纖維膜上的吸附。方法學研究表明,乙酰色氨酸在10.0μg·mL-1～160μg·mL-1濃度范圍內線性關系良好（r=0.9999）,平均加樣回收率為99.4%,RSD為0.8%。 結論：采用中空纖維離心超濾法能夠簡單方便排除人血白蛋白樣品中的蛋白對乙酰色氨酸分析的影響,所建方法適合于人血白蛋白生產過程中的質量控制。 二、中空纖維離心超濾-HPLC法測定人血漿中卡馬西平的游離濃度 目的：建立一種新型的、簡便快速的樣品前處理方法,用于血漿游離卡馬西平的分析。 方法：將未經稀釋的血漿0.2 mL置于中空纖維超濾裝置中,在9.59×102g的離心力下,離心15 min,抽取濾液20μL,直接注入HPLC分析。分析方法采用ZORBAX SB-C18 （250 mm×4.6mm,5μm）為色譜柱,流動相為甲醇-水（52：48）,流速1.0 mL·min-1,檢測波長254 nm。 結果：血漿樣品經過離心超濾后,所得濾液中的卡馬西平濃度與血漿中的游離濃度相等,可直接進行HPLC分析。色譜分析表明,游離的卡馬西平在0.624μg·mL-1～20.0μg·mL-1濃度范圍內線性關系良好（r=0.9991）,平均加樣回收率為99.5%,RSD為1.2%。分析測定了10例患者總的藥物濃度與游離藥物的濃度,并進行了相關性分析。 結論：采用中空纖維離心超濾法可在不破壞樣品生理狀態(tài)下,將游離藥物與蛋白結合的藥物分離,得到血漿中游離藥物真實的濃度信息。10例患者分析數據表明,在正常生理狀態(tài)條件下,卡馬西平的總濃度和游離濃度基本相關,但在某些條件下,特別是在病理條件下,游離藥物的濃度可能有較大的變化。因此,游離藥物的監(jiān)測對藥物的安全使用具有重要的意義。